Lignes directrices en matière de biosécurité en laboratoire : 3e édition 2004

Chapitre 9
Enceintes de sécurité biologique

9.1 Introduction

Les enceintes de sécurité biologique bien entretenues et utilisées en association avec de saines pratiques de laboratoire sont une méthode de confinement primaire efficace, adaptée à la manipulation d'agents pathogènes humains. En niveau 2, elles sont utilisées pour les procédures pouvant produire des aérosols infectieux, des concentrations élevées ou de grands volumes de matières infectieuses. En niveaux 3 et 4, toutes les manipulations de matières infectieuses utilisant des récipients ouverts doivent se faire à l'intérieur des enceintes de sécurité biologique. Tous les employés qui font des manipulations à l'intérieur des enceintes de sécurité biologique doivent avoir reçu une formation appropriée et connaître les différentes sortes d'enceintes ainsi que leur fonctionnement. D'autres documents donnent des renseignements détaillés sur la sélection, la fonction et l'utilisation de ces enceintes^(1-3).

9.2 Classes et caractéristiques des enceintes de sécurité biologique

Il existe trois classes d'enceintes de sécurité biologique : les classes I, II et III. Le choix de la classe exige une évaluation soigneuse des manipulations qui y seront faites. Les paillasses propres et horizontales qui renvoient l'air vers le manipulateur ne sont pas des enceintes de sécurité biologique et ne doivent pas servir à manipuler des matières infectieuses, toxiques ou allergènes. Seules les enceintes conformes à la norme 49-2002 de la National Sanitation Foundation (NSF), norme indépendante de conception, de fabrication et de vérification des enceintes, et portant le sceau NSF 49 devraient être achetées⁽⁴⁾.

Enceintes de classe I (figures 1a et 1b)

L'air est aspiré vers l'intérieur de l'enceinte sans être recyclé et renvoyé dans l'atmosphère après être passé par un filtre HEPA. Les enceintes de classe I protègent le manipulateur contre une contamination (le produit), mais non la matière manipulée dans l'enceinte.

Enceintes de classe II (figures 2-5)

Les enceintes de classe II protègent le manipulateur, le produit et l'environnement et sont adaptés au travail avec des microorganismes manipulés dans des laboratoires de niveaux 2, 3 et 4. Il existe deux types d'enceintes de classe II (A et B). Celles-ci sont fonction de leur construction, de la vitesse et de la direction des flux d'air ainsi que des systèmes d'évacuation d'air⁽⁴⁾.

Le type A comprend deux variantes : A1 (autrefois appelée type A) et A2 (autrefois appelée type B3). Le type B comprend les variantes B1 et B2. À cause de leurs caractéristiques, les enceintes de classe II sont les enceintes les plus répandues dans les laboratoires de recherche biomédicale.

Enceintes de classe II, type A1 (figure 2)

• L'air peut être recyclé dans le laboratoire ou évacué à l'extérieur du bâtiment par un raccord « à bague » (petite ouverture autour du boîtier du filtre d'évacuation de l'enceinte) afin d'éviter que les fluctuations du système d'évacuation d'air du bâtiment ne perturbent celui de l'enceinte. La conception de la bague ne doit pas nuire à l'obtention de l'accréditation (et doit donc permettre les vérifications par balayage du filtre HEPA).
• La vitesse frontale moyenne minimum doit être maintenue à 0,38 m/s (75 pi/min ).
• La pression des conduits et des plénums contaminés peut être positive.
• Les enceintes de classe II, type A1, ne sont pas adaptées à la manipulation de faibles quantités de substances chimiques, volatiles et toxiques, et de radionucléides volatiles (4).

Enceintes de classe II, type A2 (figure 3)

• L'air peut être recyclé dans le laboratoire ou évacué à l'extérieur du bâtiment par un raccord « à bague » (petite ouverture autour du boîtier du filtre d'évacuation de l'enceinte) afin d'éviter que les fluctuations du système d'évacuation d'air du bâtiment ne perturbent celui de l'enceinte. La conception de la bague ne doit pas nuire à l'obtention de l'accréditation (et doit donc permettre les vérifications par balayage du filtre HEPA).
• La vitesse frontale moyenne minimum doit être maintenue à 0,5 m/s (100 pi/min).
• La pression des conduits et des plénums doit être négative.
• Les enceintes de classe II, type A2, sont adaptées à la manipulation de quantités infimes de substances chimiques, volatiles et toxiques, et de traces de radionucléides.

Enceintes de classe II, Type B1 (figure 4)

• L'air passe à travers un conduit réservé rigide et est relâché dans l'atmosphère après être passé à travers un filtre HEPA. La pression des plénums est négative.
• La vitesse frontale moyenne minimum doit être maintenue à 0,5 m/s (100 pi/min).
• Trente pour cent de l'air de l'enceinte est recyclé.
• Les enceintes de classe II, type B1, sont adaptées à la manipulation de faibles quantités de substances chimiques, volatiles et toxiques, et de traces de radionucléides.

Enceintes de classe II, type B2 (figure 5)

• L'air n'est pas recyclé à l'intérieur de l'enceinte.
• La vitesse frontale moyenne minimum doit être maintenue à 0,5 m/s (100 pi/min).
• Cent pour cent de l'air de l'enceinte passe par un conduit réservé rigide et est relâché dans l'atmosphère après être passé par un filtre HEPA. La pression des plénums est négative.
• Les enceintes de classe II, type B2, sont adaptées à la manipulation de substances chimiques, volatiles et toxiques, et de radionucléides.

La hotte d'évacuation ne doit pas nuire à l'obtention de l'accréditation. Les pertes de circulation du système d'évacuation d'air du bâtiment devraient être signalées par des avertisseurs audibles dans la zone de l'enceinte. Pour éviter toute pressurisation de l'enceinte, un système de verrouillage devrait être installé pour stopper le ventilateur interne de l'enceinte en cas d'insuffisance de l'évacuation de l'air du bâtiment.

Enceintes de classe III (figure 6)

Les enceintes de classe III sont totalement fermées et étanches aux gaz. L'arrivée et l'évacuation d'air passent par des filtres HEPA. Le travail se fait au moyen de longs gants fermés et fixés au panneau de l'enceinte. L'enceinte est maintenue en dépression à au moins 120 Pa (0,5 pouce colonne d'eau), et la ventilation se fait par un système réservé d'évacuation vers l'extérieur. Ces enceintes qui protègent le manipulateur et le produit sont conçues pour manipuler des agents pathogènes de groupe de risque 4 et sont une solution de remplacement aux combinaisons à pression positive des laboratoires de niveau maximum de confinement. Les enceintes de classe III reliées en série (pour centrifugeuses, cages d'animaux, incubateurs, réfrigérateurs, etc.) et les sas de transfert qui les unissent sont généralement fabriqués sur mesure. D'autres documents fournissent des conseils précis sur les critères particuliers de construction, d'installation, d'accréditation et d'utilisation des enceintes reliées en série de classe III^(5-7). L'air évacué passe à travers deux filtres HEPA ou est traité par un filtre HEPA et incinéré. Les matières qui doivent sortir de l'enceinte sont tout d'abord décontaminées soit par un réservoir d'immersion, soit par un autoclave à double porte, soit encore par un passe-plats hermétique. Un système de verrouillage réciproque ou des protocoles appropriés doivent prévenir l'ouverture simultanée des deux portes de l'autoclave et du sas.

9.3 Installation et accréditation

Le rideau d'air à l'entrée de l'enceinte est fragile et peut facilement être perturbé par le passage de personnes marchant parallèlement à l'enceinte, par des fenêtres ouvertes, par des registres d'admission d'air ou par des appareils de laboratoire créant un mouvement d'air (pompes à vide, centrifugeuses, etc.). Les enceintes de sécurité biologique devraient être installées conformément aux exigences énoncées dans Enceintes de confinement biologique (Classes I et II) : Installation et essai en situation de l'Association canadienne de normalisation (ACNOR)⁽⁸⁾. Elles devraient être situées loin des zones de grande circulation, loin des portes et des bouches d'admission et d'évacuation d'air qui risquent de perturber les directions des flux d'air. Il convient de prévoir une distance libre d'au moins 40 cm entre tout obstacle fixé au-dessus de l'enceinte et la bouche d'évacuation. Le cas échéant, il faudrait prévoir une zone de 30 cm de chaque côté de l'enceinte afin d'en libérer l'accès pour entretien. Les ventilateurs des systèmes d'évacuation ayant des conduites rigides devraient être installés à l'extrémité distale de celles-ci. Les pannes d'évacuation d'air devraient être signalées par des avertisseurs. Pour éviter toute pressurisation de l'enceinte, un système de verrouillage devrait être installé pour arrêter le fonctionnement du ventilateur en cas d'insuffisance de l'évacuation de l'air. Un clapet antireflux peut s'avérer nécessaire pour empêcher le refoulement d'air dans le filtre HEPA.

Les enceintes de sécurité biologiques qui fonctionnent en continu facilitent le contrôle des niveaux de poussière et autres particules en suspension. L'équilibre des pressions et des flux d'air à l'intérieur du laboratoire doit tenir compte des enceintes qui ne fonctionnent qu'au besoin afin de conserver l'énergie. Dans certains cas, l'air évacué du laboratoire est équilibré de façon à intégrer l'air évacué des enceintes, et celles-ci doivent donc fonctionner en permanence.

L'approvisionnement au gaz naturel n'est pas recommandé pour les enceintes. Une flamme nue crée des turbulences dans l'enceinte, perturbe les flux d'air et peut endommager le filtre HEPA⁽¹⁾. Lorsqu'il n'existe aucune autre solution (p. ex., boucles stériles et jetables, micro-incinérateurs), des micro-brûleurs à plaque munis d'une veilleuse permettant d'allumer une flamme sur demande peuvent être utilisés.

Il convient de vérifier le fonctionnement des enceintes de sécurité biologique avant leur mise en service et tous les ans, après chaque réparation ou déménagement, en respectant les essais en situation prévus par la norme Z316.3-95 de l'ACNOR ou l'annexe F de la norme 49 de la NSF. Le déménagement d'uneenceintepeutendommagerlefiltreHEPAetses dispositifs d'étanchéité. Ces vérifications s'appliquent aux profils de vitesse verticale, à la vitesse frontale moyenne minimale, aux tests de fuites du filtre HEPA et aux flux directionnels révélés par les tests de fumée. Les appareils de mesure et de vérification doivent être calibrés et entretenus conformément à la norme de l'ACNOR. Le rapport d'accréditation doit être remis à l'utilisateur et conservé. Une étiquette précisant la date de l'accréditation, celle de la prochaine accréditation ainsi que les normes utilisées pour les vérifications et le nom du technicien vérificateur devrait être posée à l'extérieur de l'enceinte. Les vérifications en situation doivent être faites par des personnes expérimentées et qualifiées. Le programme d'accréditation de la NSF offert aux techniciens vérificateurs donne une liste d'experts ayant réussi les examens écrits et pratiques de la NSF⁽⁹⁾. Il est recommandé d'avoir recours aux services de techniciens agréés par la NSF dans la mesure du possible.

9.4 Utilisation de l'enceinte

Procédures avant l'utilisation d'uneenceintedesécurité biologique.

1. Éteindre les lumières UV le cas échéant et s'assurer que le panneau est dans la bonne position.

2. Allumer la lumière fluorescente et mettre en route le ventilateur de l'enceinte si nécessaire.

3. Vérifier que les bouches d'admission et d'évacuation d'air ne sont pas obstruées.

4. Le cas échéant, vérifier le système d'alarme et l'activer.

5. Vérifier que l'air est aspiré vers l'intérieur de l'enceinte en tenant un papier léger au milieu du bord du panneau.

6. Nettoyer les surfaces intérieures à l'aide d'un produit désinfectant adapté et non corrosif.

7. Rassembler et placer le matériel nécessaire dans l'enceinte. Ne pas obstruer les bouches d'aération. La surface de travail peut être recouverte d'un papier absorbant doublé de plastique. Séparer les articles « propres » des articles « contaminés ».

8. Activer le ventilateur 5 minutes avant de commencer à travailler afin d'éliminer les contaminants en suspension.

Procédures de travail dans l'enceinte

1. Porter des vêtements protecteurs et des gants si nécessaire.

2. Faire les manipulations le plus possible à l'arrière dans la zone de travail.

3. Ne déplacer aucun appareil et éviter tout mouvement brusque des mains et des bras dans la zone d'accès à l'avant. Glisser les mains perpendiculairement au panneau avant pour entrer ou sortir de l'enceinte. Laisser stabiliser le flux d'air de l'enceinte avant de se remettre au travail.

4. Laisser les matières rejetées, contaminées, à l'arrière de l'enceinte. Ne pas jeter de matières dans des récipients à l'extérieur de l'enceinte.

5. Ne pas travailler avec une flamme nue dans l'enceinte.

6. En cas de déversement, décontaminer la surface de tous les objets dans l'enceinte et désinfecter la surface de travail pendant que l'enceinte fonctionne (ne pas arrêter le fonctionnement de l'enceinte).

Procédures à suivre une fois le travail terminé

1. Laisser fonctionner l'enceinte 5 minutes après la fin de son utilisation.

2. Fermer ou couvrir les récipients ouverts avant de les enlever de l'enceinte.

3. Désinfecter la surface des objets ayant été en contact avec les matières contaminées avant de les enlever de l'enceinte.

4. Enlever les gants contaminés et s'en débarrasser de façon appropriée. Se laver les mains.

5. Enfiler des gants propres et s'assurer que toutes les matières sont placées dans des sacs réservés aux déchets biomédicaux dans l'enceinte.

6. Utiliser un désinfectant non corrosif (p. ex., éthanol à 70 %), désinfecter les surfaces intérieures de l'enceinte. Enlever régulièrement la surface de travail et nettoyer la surface sous-jacente (incluant le plateau de déversement). Nettoyer la surface de la lumière UV avec un produit désinfectant.

7. Éteindre la lumière fluorescente et le ventilateur de l'enceinte si nécessaire (certaines enceintes doivent fonctionner en tout temps; en cas de doute, vérifier avec le technicien vérificateur de l'enceinte, le responsable de la sécurité ou le personnel d'entretien du bâtiment).

8. Allumer la lumière UV si approprié (ne pas l'allumer si des employés travaillent à proximité). Cette lumière doit être vérifiée pour s'assurer qu'elle fonctionne à une longueur d'onde germicide (demander au technicien vérificateur de l'enceinte de réaliser ce test).

Références

1. Centers for Disease Control and Prevention. Primary containment for biohazards: selection, installation and use of biological safety cabinets. Washington, DC: U.S. Government Printing Office, 2000.

2. Kruse, R.H., Puckett, W.H., et Richardson, J.H. Biological safety cabinetry. Clin Microbiol Rev 1991;4:207-41.

3. Stuart, D.G. Primary barriers: biological safety cabinets, fume hoods, and glove boxes. Dans : Fleming, D.O., et Hunt, D.L. Biological safety principles and practices. Washington, DC: ASM Press, 2000; 313-30.

4. NSF International. Class II (laminar flow) biohazard cabinetry. Standard 49. Ann Arbor, Michigan, 2002.

5. Stuart, D.G., Hilliard , J., Kenkel, R., Kelley, J., et Richmond, J. Role of the class III cabinet in achieving BSL-4. Dans : Richmond, J.Y. Anthology of biosafety I: perspective on laboratory design. Mundelein, IL: American Biological Safety Association, 1999; 149-160.

6. National Cancer Institute Office of Research Safety and the Special Committee of Safety and Health Experts. Laboratory safety monograph, a supplement to NIH guidelines for recombinant DNA research. Bethesda, MD: NIH, 1979.

7. Biotechnology – Performance criteria for microbiological safety cabinets. BS EN 12469:2000, European Committee for Standardization (CEN), 2000.

8. Installation et essai sur place des hottes biologiques (classes I et II). Z316.3-95. Association canadienne de normalisation, Toronto, ON, 1995.

9. NSF International. NSF listings — field certifier accreditation. NSF International. Ann Arbor, Michigan, 2000.

Fig. 1a. ENCEINTE DE SÉCURITÉ BIOLOGIQUE-CLASSE I (Utilisé conjointement avec le système du bâtiment. Les ports de gant sont optionnels.)

Fig. 1b. ENCEINTE DE SÉCURITÉ BIOLOGIQUE-CLASSE I (Complète avec l'assemblage interne d'un moteur/souffleuse. L'air est évacué dans l'atmosphère après être passé par un filtre HEPA. Les ports de gant sont optionnels.)

Fig. 2. ENCEINTE DE SÉCURITÉ BIOLOGIQUE-CLASSE II, TYPE A1 (L'air de la pièce peut être recyclé ou évacué à l'extérieur du bâtiment par un raccordement "à bague".)

Fig. 3. ENCEINTE DE SÉCURITÉ BIOLOGIQUE-CLASSE II, TYPE A2 (L'air de la pièce peut être recyclé ou évacué à l'extérieur du bâtiment par un raccordement "à bague".)

Fig. 4. ENCEINTE DE SÉCURITÉ BIOLOGIQUE-CLASSE II, TYPE B1 (Conduit réversé rigide.)

Fig. 5. ENCEINTE DE SÉCURITÉ BIOLOGIQUE-CLASSE II, TYPE B2 (Conduit réversé rigide.)

Fig. 6. ENCEINTE DE SÉCURITÉ BIOLOGIQUE-CLASSE III (Conduit réversé rigide.)

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