Lignes directrices en matière de biosécurité en laboratoire : 3e édition 2004

Chapitre 7
Lignes directrices propres à certaines activités

7.1 Animaux de laboratoire

7.1.1 Exigences générales

Le travail avec des animaux entraîne toutes sortes de risques particuliers, dont des morsures et des griffures, des blessures résultant de coups et d'écrasements, des allergies et des dangers environnementaux (bruit, température), et une exposition (naturelle ou expérimentale) à des agents infectieux. L'utilisation des appareils (également appelés installations barrière) et les pratiques des animaleries doivent tenir compte non seulement du risque de transmission des agents infectieux au personnel de laboratoire, mais aussi des risques de contamination croisée entre les animaux et des moyens d'éviter que des agents adventices n'infectent par inadvertance des animaux d'expérimentation. Les installations où sont hébergés des animaux, petits ou gros, doivent être aménagées et exploitées conformément aux

Normes sur le confinement des installations vétérinaires⁽¹⁾ de l'Agence canadienne d'inspection des aliments, au Manuel sur le soin et l'utilisation des animaux d'expérimentation du Conseil canadien de protection des animaux (CCPA)⁽²⁾ et à d'autres lignes directrices et politiques du CCPA (telles que modifiées de façon subséquente). Les établissements qui utilisent des animaux à des fins de recherche, d'enseignement et d'expérimentation devraient obtenir un certificat de Bonnes pratiques animales du CCPA. Il existe des recommendations internationales fournissant de l'assistance sur l'évaluation des risques associés lors des soins et l'utilisation des animaux d'expérimentation^(3-5).

L'idéal est de concevoir des animaleries indépendantes et séparées du laboratoire. Toutefois, celles qui sont accolées à un laboratoire seront séparées des autres zones du laboratoire afin de pouvoir plus facilement être isolées et décontaminées le cas échéant. Étant donné qu'il est impossible de prévoir dans des protocoles généraux les exigences propres à chaque expérience, il convient de préparer pour chaque projet des protocoles d'entrée et de sortie du personnel scientifique, des animaliers, des animaux, des échantillons biologiques, des appareils, de la nourriture et des déchets.

La conception des installations qui hébergent des petits animaux devrait miser sur la facilité de nettoyage et de désinfection et prévoir un minimum de mobilier intégré. En général, il suffit de prévoir une petite zone de préparation, un espace d'entreposage et un lavabo pour se laver les mains. Il faut également prévoir des systèmes de cages de confinement ainsi que des installations de soutien pour les procédures animalières, le nettoyage des cages, l'élimination des déchets et les réserves de nourriture/litières. Les récents progrès technologiques d'aujourd'hui, intégrés à toute une gamme de systèmes d'habitats domotisables, permettent de contrôler des facteurs micro-environnementaux tels que la température, les échanges d'air ou l'humidité. D'autres manuels décrivent les systèmes de cage et d'élimination des litières couramment utilisés⁽⁶⁾.

Au moins 20 % des personnes qui travaillent avec des rongeurs, des cobayes et des lapins finissent par contracter des allergies⁽⁷⁾ attribuables au contact avec le poil ou la fourrure des animaux, avec leurs litières ou avec leurs déchets. Ces allergies peuvent se manifester dès la première exposition ou à la suite de multiples expositions. Les symptômes vont de simples éruptions cutanées à un asthme sévère. Il est possible de réduire les expositions inutiles grâce à des systèmes mécaniques, à un système d'aération adéquat, à des isolateurs, à des systèmes de cages de confinement, au port de protections respiratoires et à d'autres protections personnelles^(3,4).

La concentration élevée de microorganismes infectieux éventuellement présents dans les unités d'hébergement des gros animaux explique en partie le caractère particulier de ces installations. Contrairement aux laboratoires où les enceintes de sécurité biologique sont la zone de confinement primaire, les unités d'hébergement des gros animaux sont à la fois des barrières primaires et secondaires. Le personnel qui pénètre dans des unités contaminées par des volumes élevés de déchets animaux infectés doit prendre grand soin de porter des vêtements protecteurs et des dispositifs de protection personnelle. Dans les niveaux de confinement 3 et 4, des siphons de sol reliés à un système de stérilisation des effluents seront installés pour enlever et traiter efficacement les déchets d'animaux infectés. En outre, le personnel qui manipule des gros animaux doit veiller à se protéger efficacement contre tout risque de blessure grave (écrasement, etc.). Des barrières matérielles, des sangles et des systèmes d'entrée devraient être conçus et utilisés dans un but préventif. Enfin, les animaliers seront avertis des caractéristiques générales des animaux, notamment de leurs attributs physiques, de leur mentalité et de leurs instincts.

7.1.2 Primates non humains

Les risques du travail avec des primates non humains sont liés à la présence naturelle d'organismes pathogènes et aux animaux eux-mêmes. Les puissantes mâchoires et les longues canines de ces animaux provoquent des lacérations profondes et douloureuses, et leurs ongles peuvent griffer et déchirer la peau. Ce sont généralement des animaux très sales, bruyants et destructeurs. Autant de caractéristiques qui doivent entrer dans la conception des unités d'hébergement.

Les infections auxquelles s'expose le personnel en contact avec des primates non humains sont les infections bactériennes ( Salmonella , Shigella , Campylobacter, la tuberculose), les infections virales (le virus de l'hépatite A, le virus de l'immunodéficience simienne et notamment l' herpesvirus simiae ou herpèsvirus du cercopithèque 1, encore appelé herpèsvirus B), des parasites protozoaires et métazoaires (Entamoeba , Blastocystis , Trichomonas , Balantidium) et autres agents. Pour une liste plus détaillée et précise sur les agents infectieux, consulter la référence 5).

L'herpèsvirus B est un virus enzootique présent chez 70 % des macaques en captivité, y compris le rhésus et le macaque synomolgus⁽⁸⁾ , il cause des lésions orales chez le singe, son hôte naturel, mais son excrétion asymptomatique (quoique rare) des muqueuses buccales et de l'appareil uro-génital ainsi que sa présence dans le liquide conjonctival peuvent survenir sans aucun signe clinique. Au moins 50 cas d'infection humaine ayant provoqué une maladie grave ou un décès ont été documentés⁽⁹⁾. Exception faite d'un cas de transmission de personne à personne, toutes ces infections ont été contractées par des personnes exposées à des primates non humains ou à des tissus de primates non humains. La transmission aux humains semble surtout résulter d'une exposition à de la salive contaminée de primates non humains, suite à des morsures ou à des égratignures, bien qu'un cas mortel ait été signalé suite à une exposition muco-cutanée, sans blessure⁽⁸⁾. Il convient de consulter les lignes directrices disponibles sur la sécurité du travail avec des macaques, la prévention de l'herpèsvirus B et le traitement des personnes infectées^(5,8,10-12). Un programme adéquat de surveillance de la santé des animaux, mettant l'accent sur le diagnostic et le traitement des animaux malades, peut aussi réduire le risque d'exposition à ces agents pathogènes. Pour de plus amples informations sur l'identification des agents infectieux et l'évaluation des risques, consulter la référence 5. Les animaliers devraient suivre un programme de surveillance médico-sanitaire (Consulter le chapitre 2.4 et la référence 5).

Toutes les personnes qui manipulent des primates non humains doivent porter des vêtements protégeant contre les risques de morsures, de griffures et d'éclaboussures et savoir appliquer des méthodes appropriées de contention. Ces méthodes sont entre autres l'utilisation de cages à fonds mobile lorsque possible, de cages de transfert, de conduits inclinés, de tunnels et de dispositifs d'immobilisation adaptés aux primates non humains hébergés en groupe. Les cages et les appareils ne devraient avoir ni angles, ni arêtes tranchantes pouvant blesser ou écorcher. Il peut se révéler nécessaire d'utiliser une contention chimique avant de sortir les animaux de leurs cages, surtout les macaques et autres primates non humains de grande taille. Des techniques de conditionnement du comportement peuvent aussi être utilisées avec profit, en association avec des méthodes de contention. Les animaliers doivent se protéger avec des gants en cuir renforcés couvrant tout le bras et porter des sarraus ou des combinaisons à manches longues. Les animaliers et toutes les personnes qui pénètrent dans des animaleries où sont hébergés des primates non humains doivent être protégés contre une exposition aux aérosols et contre des éclaboussures et les muqueuses (masques chirurgicaux, masques protecteurs, lunettes de travail). Les vêtements protecteurs réutilisables qui ont été en contact avec des primates non humains devraient être décontaminés avant d'être envoyés à la blanchisserie. Les animaliers doivent avoir pour instruction de désinfecter sans délai et à fond toutes les morsures, égratignures et lésions cutanées, et de signaler immédiatement tout incident du genre. Des procédures post-exposition devraient également être instituées^(5,12).

Les animaleries hébergeant des primates non humains devraient se conformer aux recommandations sur les installations de confinement des petits animaux des Normes sur le confinement des installations vétérinaires⁽¹⁾. Les primates non humains (exception faite de ceux qui ont été expérimentalement infectés avec des agents pathogènes de groupe de risque plus élevé et de ceux dont on sait qu'ils sont porteurs d'organismes infectieux de groupe de risque plus élevé) peuvent être manipulés dans des installations de niveau de confinement 2 à condition de respecter les pratiques et précautions additionnelles de sécurité décrites ci-dessus. Il faut considérer et traiter toutes les colonies de macaques comme si celles-ci étaient naturellement infectées avec l'herpèsvirus B, y compris celles pour lesquelles il a été impossible de mettre en évidence la présence d'anticorps contre ce virus^(5,9).Le Manuel sur le soin et l'utilisation des animaux d'expérimentation précise les exigences d'hébergement et de manipulation des primates non humains⁽²⁾ , et d'autres renseignements sur les installations des primates non humains sont disponibles ailleurs⁽¹³⁾. D'une façon générale, l'hébergement de ces animaux doit tenir compte des préoccupations ci-dessous.

1. La conception des installations d'hébergement des primates non humains doit respecter les besoins sociaux, émotionnels et comportementaux de ces animaux.

2. Des informations sur les animaliers d'expérience et sur la personne responsable doivent être disponibles partout dans ces installations.

3. Les unités d'hébergement doivent avoir un vestibule ou être aménagées de façon à ce que deux portes séparent les cages et le couloir du bâtiment. Il convient de s'assurer de pouvoir voir toutes les cages et de vérifier que les animaux n'y sont pas en liberté avant d'y pénétrer.

4. Tous les dispositifs d'éclairage, tous les appareils électriques et toute la tuyauterie apparente doivent être protégés contre les tentatives de détérioration des animaux.

5. Pour des motifs d'hygiène quotidienne obligatoire, les sols doivent être antidérapants et le personnel doit porter des chaussures adhérantes aux sols mouillés, glissants. La finition des murs et des plafonds doit pouvoir résister à des nettoyages en profondeur et aux procédures de désinfection.

6. Le personnel souvent en contact avec les animaux doit avoir accès à un vestiaire et pouvoir se doucher en fin de journée.

7. Les cages et les animaleries doivent être verrouillées en tout temps et n'être accessibles qu'au personnel autorisé. Les verrous de sûreté et les mécanismes de verrouillage doivent tenir compte de l'intelligence, de la ténacité et des aptitudes créatrices et destructrices des primates non humains.

8. Le matériel (chariots, balances, plats pour la nourriture, pelles, gants, etc.) qui circule entre les animaleries doit être correctement désinfecté chaque fois qu'il quitte une pièce, conformément aux règles appropriées au niveau de confinement.

9. Les cages doivent être bien entretenues et suffisamment solides pour ne pas être endommagées par les primates non humains.

10. Les cages doivent être munies d'un mécanisme d'immobilisation permettant de maîtriser et d'examiner les animaux. Des cages de transfert et d'autres appareils de contention particuliers peuvent être utilisés pour héberger les animaux en toute sécurité lorsque leurs cages sont nettoyées ou que ceux-ci doivent être déplacés.

11. La sélection des primates non humains destinés à vivre dans la même cage doit tenir compte de leur compatibilité, de la dynamique de population des espèces, etc., pour réduire les risques de bagarres.

7.2 ADN recombinant et manipulations génétiques

Des méthodes génétiques telles que la sélection naturelle, les croisements, les conjugaisons et transformations bactériennes servent depuis des années à modifier les organismes et les espèces biologiques. Ces méthodes ont été supplantées par d'autres, plus récentes et plus efficaces, dont la plus célèbre est celle de l'ADN recombinant. Parmi d'autres techniques encore plus récentes, signalons la production d'animaux et de plantes transgéniques, le clonage de toxines microbiennes ou autres gènes de virulence dans un vecteur d'expression ou dans un autre organisme permettant son expression, la production de clones viraux infectieux entiers, y compris la reconstruction de virions infectieux à partir de gènes recombinants (techniques de génie génétique inversé).

Les craintes initiales liées à d'éventuels risques associés aux modifications d'organismes ont incité le Canada, les États-Unis et le Royaume-Uni, pour ne citer que ces pays, à élaborer des principes de biosécurité très stricts. L'expérience a néanmoins rapidement prouvé que ces craintes n'étaient pas justifiées et confirmé que la plupart de la recherche sur l'ADN recombinant ne posait en soi aucun risque précis de biosécurité⁽¹⁴⁾.

Il existe des conseils d'évaluation des risques pouvant être associés à la recherche sur l'ADN recombinant^(15,16) ,mais ceux-ci demeurent très généraux. Au minimum, le choix du niveau de confinement propre à un organisme recombinant devrait dépendre :

1. du niveau de confinement de l'organisme récepteur,

2. du niveau de confinement de l'organisme donneur,

3. de la faculté de réplication de l'organisme recombinant,

4. de la capacité d'intégration de la protéine donatrice à la particule recombinante,

5. des facteurs pathogènes pouvant être associés à la protéine donneuse.

Chaque cas doit faire l'objet d'une évaluation de risque, car nul ne peut prétendre définir à l'avance tous les organismes génétiquement modifiés qui peuvent être créés ou manipulés en laboratoire. Pour une aide d'évaluation du risque, veuillez communiquer avec le Bureau de la sécurité des laboratoires, au (613) 957-1779.

Les risques liés à la grande majorité de la recherche sur l'ADN recombinant sont infimes car la source de l'ADN transféré, le vecteur et l'hôte sont tous inoffensifs – ce qui ne veut pas dire que certaines manipulations génétiques ne comportent pas unepartderisqueimportante.Engénéral,ilestinutile d'imposer des restrictions lorsqu'aucun élément de la manipulation génétique ne présente un risque connu et que le résultat de leur combinaison ne laisse raisonnablement envisager aucun risque. Lorsque l'un des éléments de la recombinaison entraîne un risque, le choix du niveau de confinement requis devrait, en général, correspondre au moins au niveau approprié au risque connu. Certaines considérations, dont le gène transféré, l'expression du gène dans l'organisme recombinant, le confinement biologique offert par les systèmes hôte-vecteur, les interactions envisagées entre le gène transféré et les systèmes hôte-vecteur et la viabilité des systèmes hôte-vecteur, peuvent amener à relever ou à réduire le niveau de confinement. Tous les travaux de recherche utilisant des gènes codant pour des produits dangereux devraient utiliser des systèmes hôte-vecteur n'ayant qu'une faible capacité de survie en dehors du laboratoire; leur manipulation réduira le niveau de confinement requis.

Quelques exemples :

1. Un virus recombinant, mais défectif, de la stomatite vésiculeuse exprimant une glycoprotéine provenant d'un autre virus devrait être manipulé en niveau de confinement 2 car il ne peut se reproduire.

2. Un virus recombinant de la stomatite vésiculeuse exprimant une glycoprotéine provenant d'un autre virus devrait être manipulé dans un niveau de confinement au moins égal à celui du virus car il pourrait se reproduire et que son tropisme aurait pu être modifié.

3. Un virus recombinant de la vaccine exprimant une glycoprotéine provenant d'un autre virus devrait être manipulé dans un niveau de confinement au moins égal à celui du virus de la vaccine de phénotype sauvage, car la protéine nouvellement synthétisée par ce virus ne serait pas intégrée à la particule virale et risquerait peu d'en modifier les propriétés biologiques.

7.3 Lignées cellulaires

Les lignées (cultures) cellulaires sont couramment utilisées aussi bien dans les laboratoires de diagnostic et de microbiologie que dans l'industrie, pour la production de médicaments. Certains cas d'infections contractées en laboratoire résultant de manipulations de cultures cellulaires primaires ont été signalées^(17,18). Bien que les lignées cellulaires n'entraînent en soi aucun risque pour le personnel qui les manipule en laboratoire⁽¹⁹⁾ , les risques qu'elles renferment des organismes pathogènes — soit naturellement, soit par contamination par des agents adventices, par transformation ou par recombinaison — exigent que l'on évalue le niveau de risque associé à chacune d'elles⁽²⁰⁾. Les lignées peuvent être contaminées par des bactéries, des mycètes, des mycoplasmes, des virus et des prions.

7.3.1 Évaluation du risque

Lignées cellulaires ne résultant pas d'une recombinaison génétique

Toutes les nouvelles lignées manipulées en laboratoire doivent faire l'objet d'une évaluation détaillée de risque permettant de déterminer les précautions à prendre. Ces évaluations doivent au minimum tenir compte des facteurs ci-dessous.

• origine de la lignée cellulaire – plus celle-ci est phylogénétiquement proche des humains, plus le niveau de risque est élevé (du risque le plus élevé au plus faible : source autologue humaine, hétérologue humaine, primate, autre mammifère, aviaire, invertébrée⁽²¹⁾ );
• origine du tissu – donne des indications sur les éventuels contaminants et virus latents (oncogènes);
• type de lignée cellulaire – du risque le plus élevé au plus faible : cellules en culture primaire, cellules en culture continue, cultures cellulaires bien caractérisées;
• quantité de cellules par culture;
• population d'origine du spécimen d'où provient la lignée cellulaire.

Lignées cellulaires résultant d'une recombinaison génétique (les facteurs ci-dessous s'ajoutent aux considérations ci-dessus)

• propriétés de la lignée cellulaire hôte (dans le cas d'hybridomes, tenir compte des propriétés de toutes les cellules fusionnées);
• vecteur utilisé pour la transformation (le niveau de confinement peut être accru);
• transfert des séquences virales (le niveau de confinement peut être accru);
• transfert des facteurs de virulence (le niveau de confinement peut être accru);
• activation des virus endogènes (le niveau de confinement peut être accru);
• produit génique recombinant (le niveau de confinement peut être accru);
• présence d'un virus assistant (le niveau de confinement peut être accru);

Les dangers liés à la manipulation d'une lignée cellulaire donnée peuvent être évalués dès que tous les renseignements pertinents, y compris ceux sur les dangers associés aux milieux qui seront utilisés au cours de la manipulation de la culture cellulaire, ont été obtenus. La lignée cellulaire sera manipulée au niveau de confinement approprié au niveau de risque.

7.3.2 Contamination par des agents infectieux

Bactéries et mycètes

Les lignées cellulaires contaminées par des bactéries et des mycètes sont facilement identifiées lorsqu'elles poussent dans des milieux sans antibiotiques, car les contaminants supplantent rapidement la croissance des lignées cellulaires⁽²⁰⁾.

Contamination virale

À la différence des bactéries et des mycètes, les virus ne sont pas facilement repérables et peuvent donc représenter un danger important pour les personnes qui manipulent des lignées cellulaires primaires. Un cas documenté d'infection par hantavirus contractée en laboratoire a été relié à la manipulation de matériel tumoral de rat⁽²²⁾. L'Organisation mondiale de la Santé a proposé une classification des lignées cellulaires basée sur la probabilité de chacune d'être des vecteurs de virus pathogènes pour les humains⁽²³⁾.

• Probabilité faible : lignées provenant de tissus aviaires et de tissus d'invertébrés.
• Probabilité moyenne : cellules non hématogènes de mammifères, par exemple cellules fibroblastiques et épithéliales.
• Probabilité forte : cellules sanguines et médullaires provenant d'humains ou de primates non humains, cellules hypophysaires humaines, cellules ovines et caprines, notamment d'origine neuronale, hybridomes lorsqu'au moins un des partenaires de la fusion est d'origine humaine ou primate non humaine.
• Des oncogènes viraux et cellulaires ont été dépistés, notamment le virus du lymphome humain à cellules T (HTLV-1), virus oncogène humain qui transforme les cellules normales en des cellules malignes⁽²¹⁾.
• Les lignées cellulaires infectées par des contaminants connus ou éventuels doivent être manipulées au niveau de confinement correspondant à l'agent contaminant de niveau de risque le plus élevé.

L'un des principaux dangers liés à la manipulation de cultures cellulaires est l'expression de virus latents. Des séquences virales endogènes ont été trouvées dans une variété de lignées cellulaires provenant d'espèces de mammifères, y compris d'humains⁽²⁰⁾. Différents traitements (changement de pH, niveau de sérum, température, supplément au milieu, co-culture, etc.) peuvent modifier la croissance des lignées cellulaires. Ces traitements peuvent influencer l'expression des protéines de surface et l'expression des oncogènes et des virus latents ainsi que les interactions entre les segments génomiques recombinants⁽²¹⁾ .

• Les manipulations qui peuvent modifier le comportement « normal » des lignées et les rendre plus dangereuses doivent être faites dans des installations d'un niveau de confinement approprié au nouveau degré de danger.

Le choix du niveau de confinement doit tenir compte des dangers biologiques associés aux lignées cellulaires des primates non humains. Les lignées primaires provenant du genre Macaca pouvent être infectées par l'herpesvirus simiae (ou l'herpèsvirus du cercopithèque 1, l'herpèsvirus B). Ainsi les tissus de ces animaux doivent être manipulés comme suit :

• En laboratoire de niveau 2 pour des manipulations de tissus ou de liquides biologiques de macaques;
• En laboratoire de niveau 3 en cas de doute, avéré ou non, d'herpèsvirus B;
• En laboratoire de niveau 3 pour des diagnostics primaires in vitro;
• En laboratoire de niveau 4 en cas de propagation (culture) du virus.

Prions

Le prion, ou particule protéique infectieuse, est l'agent causal des encéphalopathies spongiformes transmissibles, dont l'encéphalopathie bovine spongiforme^(24,25).

• Les cultures cellulaires d'origine bovine qui sont ou qui seraient infectées par des prions responsables de l'encéphalopathie bovine spongiforme, et les diagnostics primaires in vitro des cultures cellulaires d'origine bovine qui sont ou qui seraient infectées par des prions responsables de l'encéphalopathie bovine spongiforme doivent être manipulés selon les lignes directrices EST. L'information et les lignes directrices EST peuvent être obtenues en communicant avec l'ACIA, Division des biorisques, du confinement et de la sécurité, (613-221-7074) ou en consultant son site Web, à http://www.inspection.gc.ca/francais/tocf.shtml

Mycoplasmes

Bien qu'il soit couramment admis que les mycoplasmes peuvent contaminer des cultures cellulaires, aucune infection contractée en laboratoire par des cultures contaminées avec des mycoplasmes n'a été signalée. La présence de produits mycoplasmiques biologiquement actifs, la stabilité des antigènes des mycoplasmes⁽²¹⁾ et le fait qu'un certain nombre de ces mycoplasmes sont des agents pathogènes humains expliquent cependant le danger qu'ils représentent.

• Les lignées cellulaires contaminées par des mycoplasmes doivent être manipulées dans un laboratoire de niveau de confinement approprié à l'agent contaminant associé à la classe de risque la plus élevée.

Parasites

La contamination parasitaire de lignées cellulaires primaires fraîchement préparées est possible si le spécimen provient d'un tissu infecté ou éventuellement infecté par un parasite humain. Le choix du niveau de confinement doit tenir compte du fait que les parasites ne sont infectieux que pendant certaines des nombreuses étapes de leur cycle de vie.

• Lorsque l'on ne connaît pas l'étape du cycle de vie du parasite, et que l'on ignore donc si celui-ci est infectieux, les lignées cellulaires doivent être manipulées dans un laboratoire de niveau de confinement approprié à l'agent contaminant appartenant à la classe de risque la plus élevée.

7.3.3 Expérimentation sur soi

Les procédures ou expériences avec des cellules humaines transformées provenant des personnes mêmes (autologues humains) qui manipulent les cellules sont interdites. En pareil cas, ces personnes sont en danger car toute forme de protection immunitaire normalement disponible pour détruire les cellules étrangères est dès lors contournée^(20,21).

Références

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2. Conseil canadien de protection des animaux. Manuel sur le soin et l'utilisation des animaux d'expérimentation .Ottawa,ON: CCAC., 1984.

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